核酸的变性
核酸的变性是指在特定因素作用下,其双螺旋区因氢键和碱基堆积力的破坏而发生解链的过程。核酸的变性可以是局部的,也可能发生在整个核酸分子上,但与蛋白质变性一样,不涉及任何共价键的断裂。
导致核酸变性的因素
凡能破坏稳定双螺旋构象的因素(如氢键和碱基堆积力),以及增强不利于双螺旋稳定的因素(如磷酸基的静电斥力和碱基分子的内能)都可以成为变性的原因,如加热、碱性pH、低离子强度、有机试剂(甲醛、甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺)等,均可破坏双螺旋结构引起核酸分子变性。
如要维持DNA单链状态,可保持pH大于11.3,以破坏氢键:或者盐浓度低于0.01 mol/L,此时由于磷酸基团间的静电斥力,使配对的碱基无法相互靠近,碱基堆积作用也处在最低水平。
常用的DNA变性方法主要是热变性和碱变性,热变性使用得十分广泛,热能使核酸分子热运动加快,增加了碱基的分子内能,破坏了氢键和碱基堆积力,最终破坏核酸分子的双螺旋结构,引起核酸分子变性。
热变性常用于变性动力学的研究,然而高温可能引起磷酸二酯键的断裂,得到长短不一的单链DNA。而碱变性方法则无此缺点,在pHI 1.3时,几乎全部氢键都被破坏,DNA完全变成单链的变性DNA。
碱性条件之所以能够导致DNA变性,是因为碱基在此条件下更容易发生互变异构,致使原来碱基对之间的氢键被破坏。
变性引起的核酸理化性质的改变
核酸在变性时,其一系列理化性质会发生改变,例如紫外吸收、浮力密度、旋光性、黏度和沉降速率等。至于生物活性是否变化,则取决于是什么核酸。
增色效应
核酸变性时,紫外吸收增加。此现象称为增色效应。增色效应产生的原因是:双螺旋结构之中的碱基堆积作用降低了紫外吸收,在变性以后,碱基堆积作用被削弱,这时每一个碱基的紫外吸收都能充分表现出来,紫外吸收随之升高。上述性质的变化可作为检测核酸变性的一个重要指标。
浮力
变性还可以增加DNA的浮力密度,这是因为变性后的DNA会像单链的RNA一样,通过链内的互补碱基配对形成更加致密的结构。
黏度
变性还能降低DNA溶液的黏度。DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构,变性后代之以“柔软”而松散的无规则单股线性结构,DNA黏度因此而明显下降。
沉降速度
当变性改变了DNA的浮力密度和黏度以后,其离心时的沉降速度必然改变,变化的趋势应该是增加。另外,变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构象改变,使DNA溶液的旋光性发生变化。
生理功能
有关变性能否影响到核酸的生物学功能,在这里有必要将它与蛋白质变性作一比较。两者都仅仅涉及一级结构以上结构层次的破坏和次级键发生断裂,且共价键不受影响。
然而,蛋白质变性强调的是蛋白质三维结构的破坏。如果蛋白质发生变性,其三维结构肯定遭到了破坏,它的生物学功能也必然丧失。
而核酸的变性强调的是二级结构即双螺旋结构的破坏,它与核酸的生物学功能是否丧失没有必然的联系。
如果核酸是DNA,则变性并不会使其生物学功能丧失,反而有利于它的生物学功能的发挥,这是因为DNA的生物学功能是贮存、复制及转录遗传信息,而遗传信息是贮存在一级结构之中的,DNA在变性的时候,一级结构并没有发生任何破坏。
此外,无论是DNA复制,还是转录,第一步都需要DNA发生解链,这实际上就是DNA的变性。例如,体外复制DNA(即PCR)的第一步反应就是热变性。
如果核酸是RNA,变性是否破坏其生物学功能,需要区别对待。那些生物学功能直接由高级结构决定的RNA,如tRNA、rRNA、SnRNA、snoRNA和核酶,一旦发生变性,就会像蛋白质一样,生物学功能立刻丧失。
而对于那些生物学功能直接与一级结构有关的RNA,如mRNA和RNA病毒的基因组RNA,变性则不会破坏它们的生物学功能。