蛋白质的分离和纯化

蛋白质的分离和纯化，不仅有助于研究蛋白质本身的结构和功能，还有助于研究其基因的结构与功能。

例如，如果无法直接得到一种蛋白质的基因，那么通过纯化蛋白质，就可以测定出它的一部分氨基酸序列，然后根据遗传密码表设计和制备核酸探针，去“钓”出它的基因。

或者以纯化的蛋白质免疫动物得到抗体，从cDNA表达文库中分离出它的基因；如果已经分离出一种蛋白质的基因，只有在纯化到这种基因编码的蛋白质产物以后，才可以对其结构、性质及其功能进行全方位的研究。此外，具有工业或药用价值的蛋白质也需要得到它们的纯品。

然而，纯化一种蛋白质并非易事。能否成功既取决于蛋白质固有的结构和性质，也与纯化人员的创意、技巧、耐心甚至运气等因素有关。可以说，每一种蛋白质的纯化步骤不可能是完全相同的，但每一种蛋白质纯化所应用的方法原理都差不多。假定有一个合理的测活方法和好的原材料，只要有时间、金钱和耐心，纯化出任何一种蛋白质都是可能的。

蛋白质纯化的准备工作

在进行蛋白质纯化实验之前，首先要解决3个问题：①纯化蛋白质的目的：②目标蛋白的测活方法：③纯化蛋白质的原料。

明确纯化蛋白质的目的

不同的研究者纯化蛋白质的目的可能会不一样。有的是为了获得晶体，去进行X射线衍射分析；有的是为了测定一级结构：有的是将其作为药品投入市场。

显然，目的不同，需求量就不同：若是进行测序或质谱分析，约需要1 怕mol；若是制备抗体，需要200~500 μg：若是做荧光分析、圆二色性和测热法等结构分析，需要量在1-10mg：如果做X射线衍射，需要10 mg或者更多：而如果是作为药用和工业之用，则是多多益善。

此外，纯化蛋白质目的不同，对蛋白质纯度的要求也会不同。例如，测序之用的蛋白质纯度要在97%以上，而药用的蛋白质的纯度要求更高。

建立蛋白质活性测定的方法

在纯化一种蛋白质之前，首先需要建立一种检测它存在的方法。不同的蛋白质通常具有不同的活性，因此，检测它是否存在以及存在多少，可以借助测定它特有的活性以及活性的高低来进行。

换句话说，检测一个蛋白质的方法仅仅是以一种定量的方法测定一个特定活性存在的量。

蛋白质活性测定的方法通常根据它的生物功能来设计。例如，如果是酶，就测定它的催化活性；如果是刺激细胞分化的蛋白质，就测定它刺激特定细胞分化的能力；如果是细胞凋亡蛋白，则测定它刺激特定细胞死亡的能力。

在选择测活方法的时候，要牢记两个标准：

①测定是不是灵敏、方便。如果一种测活方法灵敏度较低，那就意味着需要大量目标蛋白才能显示它是否存在，而做到这一点通常是十分困难的。

同样，如果一种测定方法需要花几天的时间才能完成，就会大大影响到实验的进程，并且时间越长，蛋白质越容易发生变性和水解。

②测定的方法是不是高度专一，需要防止功能相近的蛋白质产生干扰。

选择含有目标蛋白的原材料

对含有特定目标蛋白原材料的选择，往往直接关系到纯化是成功还是失败。选择目标蛋白含量高的原材料是一般原则。

例如，乙酰胆碱受体在肌细胞中含量非常少，因此，如果想从肌肉中分离乙酰胆碱受体，可以说成功的可能性十分渺茫。但如果选择电鳐的电板作为原材料，纯化就要容易得多，这是因为电板细胞的一面密集了大量的乙酰胆碱受体。

再如，从肾细胞中纯化水孔蛋白是一种很好的选择，因为肾与水代谢有密切关系，构成其细胞的质膜上应该富含这种蛋白质。

还有，从单细胞真核生物四膜虫体内分离端聚酶是非常明智的选择，因为单细胞真核生物只要条件允许，会像细菌一样一直在分裂，因此这种酶的活性会一直很高，这样才能使其端粒DNA维持完整。

有时，某些蛋白质的含量本来就很低，难以找到富含它的组织，这时可考虑先得到它的基因，然后利用基因工程进行高表达后再进行分离、纯化。

蛋白质纯化的一般注意事项

在纯化任何一种蛋白质的时候，都要时刻注意维护它的稳定，保护它的活性。有一些通用的注意事项需要牢记，它们包括：

①操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行：

②不要太稀，蛋白质浓度维持在μg/ml~mg/mL；

③合适的pH，除非是进行聚焦层析或等电点沉淀，所使用的缓冲溶液的pH避免与pI相同：

④使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解：

⑤避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性：

⑥缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境：

⑦在缓冲溶液加入0.17 mmol/L DTT或β-巯基乙醇，防止蛋白质的氧化：

⑧加1~10 mmol/L 'EDTA金属螯合剂，防止重金属对目标蛋白结构的破坏：

⑨使用灭菌溶液，防止微生物生长。