蛋白质理化参数的测定

蛋白质大小的确定

大小是蛋白质一个重要的特征常数，当发现一种新的蛋白质的时候，首先应准确地测定出它的大小。测定蛋白质大小即相对分子质量的方法主要有SDS-PAGE、凝胶过滤层析、超速离心法和质谱。此外，还有光散射法和渗透压法也可以测定蛋白质的大小。

SDS-PAGE

这是实验室最常见的测定蛋白质大小的方法，其基本原理和步骤是：蛋白质相对分子质量与电泳迁移率间的关系可用下式表示：Ig Mr=k-bm。

式中Mr为相对分子质量，k为常数，b为斜率即为迁移率。

因此，若要用本法测定蛋白质的相对分子质量，需要用几种已知大小的蛋白质为标准，进行电泳，以每种蛋白质相对分子质量的对数对电泳迁移率作图，绘制出标准曲线。

未知蛋白质在同样的条件下进行电泳，根据它的迁移率，从标准曲线上即可求出。

凝胶过滤法

其测定蛋白质大小的基本原理和步骤则是：由于不同排阻范围的凝胶有一特定的蛋白质相对分子质量的范围，在此范围内，相对分子质量的对数和洗脱体积之间呈线性关系。

因此，用几种已知大小的蛋白质为标准，进行凝胶层析，以每种蛋白质的洗脱体积对它们的相对分子质量的对数作图，可绘制出标准洗脱曲线。

未知蛋白质在同样的条件下进行凝胶层析，根据其所用的洗脱体积，从标准洗脱曲线上可求出此未知蛋白质的大小。

超速离心法

其测定蛋白质大小的基本原理和步骤是：蛋白质溶液经高速离心分离时，由于比重关系，蛋白质分子趋于向下沉降，沉降速率与蛋白质颗粒大小成正比，应用光学方法观察离心过程中蛋白质颗粒的沉降行为，可判断出蛋白质的沉降速率。

根据沉降速率可求出沉降系数S，将S带人公式，即可计算出蛋白质的相对分子质量。质谱法质谱法具有较好的灵敏度、准确度，能精确地测定出蛋白质相对分子质量、肽链氨基酸排序以及含有二硫键的蛋白质的二硫键的数目和位置，因此现在在蛋白质结构研究中占据十分重要的地位。

质谱法

测定蛋白质相对分子质量的基本原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白。通常结合相应的处理及其他技术，能够比较准确、快速地鉴定蛋白质。

蛋白质等电点的测定

测定蛋白质pI的方法主要有等电点沉淀和等电聚焦，其中等电聚焦更精确。

虽然现在有专门的软件可对一级结构已知的蛋白质的pI直接预测，但是预测的结果不一定与真实的值相符，因为一种蛋白质的pI除了与一级结构有关以外，还与三维结构有关。

因此，要想确定一种蛋白质的真实的pI，还得靠实验来测定。

蛋白质在机体内表达的分析

研究一种蛋白质在机体内的表达状况，可使用Western印迹（WB）来测定。

这种方法的基本原理是：一种蛋白质与其抗体之间的结合是高度特异性的，因此可以用它的抗体来对其进行定性和定量分析。然而，抗体本身并没有颜色，因此需要将一种酶将其偶联在一起。

偶联的酶可在抗体结合的地方原地催化反应，并将无色的底物变成有色的产物，借此可显示作为抗原的目标蛋白的存在。

理论上，可将酶直接偶联在目标蛋白的抗体上，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。但在实际操作的时候，是将酶偶联在以目标蛋白的抗体作为抗原制备而成的二级抗体上。

这样的好处是不同蛋白质虽然一级抗体是不同的，但是二级抗体却是通用的。这是因为二级抗体是由一级抗体的不变区作为抗原去免疫另外一种动物制备而成的，来自同种动物不同的一级抗体可变区不一样，但不变区是一样的。

这种方法之所以称为印迹，是因为不同的蛋白质在经凝胶电泳分离后，需要将它们从凝胶上通过吸印的方法转移到机械性能更好的滤膜等材料上，才可以进行后面的鉴定。