蛋白质纯度的测定
纯净的蛋白质样品不应该含有其他杂蛋白和杂质。
一般认为,当一种蛋白质被纯化到恒定的比活性或达到均一性以后,就可认为是纯品了。然而,单凭恒定的比活性是不够的,还需要使用其他的方法加以验证。
其他鉴定蛋白质纯度的方法有:电泳法如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦和毛细管电泳等。
电泳法
纯净的蛋白质电泳的结果应该是一条带。如果使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,就要特别小心,原因是SDS能够破坏蛋白质的四级结构,而导致异源寡聚体蛋白质可能出现几条带。
电泳法检测蛋白质的纯度时,应取分布在蛋88白质等电点两侧的两个不同的pH分别进行检测.这样得出的结论才更可靠。
化学法
化学法进行N端或C端测定,纯品蛋白质应该具有恒定的N端或C端组成。如果一种蛋白质只有一条链组成,就只会检测到一种N端或C端氨基酸。
仪器法
仪器法使用HPLC或质谱进行分析。如果一种蛋白质样品在HPLC上只表现单一的峰,则可视为其为纯品;如果纯化的是一种已知蛋白,经质谱分析测定出来的相对分子质量与实际的值一致,那么也可认为它是纯品。
检测蛋白质的纯度,必须综合两种原理不同的分析方法才能做出准确的判断。例如,仅仅用凝胶过滤和SDS-PAGE来确定一个蛋白质样品是否纯净是欠妥的,因为这两种方法的原理是都是根据大小分离蛋白质。